我打算做一個RNA-seq項目，研究一株細(xì)菌在兩個環(huán)境條件下的表達(dá)差異?，F(xiàn)在，我打算確定生物學(xué)重復(fù)的個數(shù)，以便可以得到統(tǒng)計學(xué)上有意義的結(jié)果。我打算每個環(huán)境的樣本設(shè)置兩個生物學(xué)重復(fù)，而不打算測更多重復(fù)。請問，兩個重復(fù)的設(shè)置是否合理？

1.如果是我的話，我會選擇設(shè)置三個生物學(xué)重復(fù)。要知道兩個生物學(xué)重復(fù)意味著雙倍的工作量但沒有雙倍的效果。如果做兩個生物學(xué)重復(fù)，你會引入無法校正的噪音。如果兩個重復(fù)結(jié)果一樣，那能說明問題，但如果不一樣，你就解釋不了了。如果樣品制備不是非常難，經(jīng)費不是非常有限，我建議還是設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)吧。

2.這是個有意思的問題，從統(tǒng)計學(xué)的角度來說
排除生物學(xué)意義，從統(tǒng)計學(xué)的角度來說，不同的統(tǒng)計方法，對生物學(xué)重復(fù)的個數(shù)的要求并不相同。
如果使用T檢驗，你應(yīng)該設(shè)置盡可能多的生物學(xué)重復(fù)，建議至少3個重復(fù)。當(dāng)然T檢驗的方法，在RNA-seq的差異分析里不是很合理。因為RNA-seq的誤差分布，并不符合正態(tài)分布。
如果你選擇的統(tǒng)計模型是Fisher 精Que檢驗類的統(tǒng)計模型（包括超幾何分布或泊松分布），即使沒有生物重復(fù)也是可以進(jìn)行統(tǒng)計的。當(dāng)然，沒有生物學(xué)重復(fù)只是在統(tǒng)計學(xué)上可行，但實際上無算估算生物差異或?qū)嶒炚`差帶來的系統(tǒng)誤差。所以，這樣的策略現(xiàn)在發(fā)表論文的話，可能會被質(zhì)疑的。
如果你選擇一些軟件，例如Deseq這樣的軟件，一般也要求2個以上的生物學(xué)重復(fù)。

這個是非常有意思的問題，我提供的建議非常有限，期望其他人有更好的回答。

“虎式坦克”的回答不錯。關(guān)于生物學(xué)重復(fù)與統(tǒng)計的關(guān)系，我補充一下。在我們的測序樣本中，每一個基因表達(dá)量的方差包含兩個方面的內(nèi)容：
1）處理方差，就是我們的實驗處理導(dǎo)致的差異，這些差異當(dāng)然就是我們關(guān)注的；
2）誤差方差，就是與我們實驗處理無關(guān)的差異，例如，生物個體間的差異，實驗技術(shù)不穩(wěn)定導(dǎo)致的偏差等。誤差方差并非我們關(guān)注的，但這些差異會引入假陽性。

所以生物學(xué)重復(fù)的價值在于幫助我們估算誤差方差的大小，從而我們可以從總體方差中剔除誤差方差的影響。

以上的內(nèi)容，就是生物統(tǒng)計學(xué)中“方差分析”所講的內(nèi)容。其實RNA-seq差異分析的主體思路和方差分析基本相同，只是把誤差分布的假設(shè)從方差分析的正態(tài)分布，替換為了其他更合理的分布，例如負(fù)二項分布。 那么，生物學(xué)重復(fù)在這里的意義就是用于計算誤差方差的大小。因為生物學(xué)重復(fù)間不存在處理效應(yīng)，任何差異都屬于誤差方差的范疇。

但還需要補充一點，由于我們大部分二代測序只有2~3個生物學(xué)重復(fù)。這么少的重復(fù)數(shù)，正確預(yù)估每個基因誤差方差其實是不夠的（也就是單個基因的方差估計很不穩(wěn)定）。所以，一般的差異表達(dá)分析軟件（例如，Deseq，edgerR）使用了一個代償?shù)姆椒?。這個方法假設(shè)：對于表達(dá)量相似的基因，其誤差方差也應(yīng)該是相似的。所以在Deseq里面，會使用所有基因的方差獲得擬合曲線，來獲得不同表達(dá)量的基因的期望方差（如下圖）。在重復(fù)數(shù)比較少的情況下，擬合得到的期望方差理論上會比單個基因的估算更準(zhǔn)。

回答完統(tǒng)計學(xué)角度的問題，我們再從生物學(xué)試驗設(shè)計的角度來考慮重復(fù)數(shù)設(shè)置的問題。我們一般會建議老師測3個生物學(xué)重復(fù)，除了統(tǒng)計角度的考慮，還有考慮試驗的意外因素。如果測兩個重復(fù)，而其中一個樣本發(fā)現(xiàn)有問題而需要被剔除，就會導(dǎo)致這組數(shù)據(jù)將非常不可信。但如果我們有三個重復(fù)，剔除一個樣本后，依然留有兩個樣本，保證這組數(shù)據(jù)依然是有重復(fù)的。

我認(rèn)為從統(tǒng)計的角度，4個重復(fù)是理想的。當(dāng)然，從費用的角度來說，目前依然是太貴了。隨著測序價格不斷下降，重復(fù)的設(shè)置應(yīng)該會慢慢提高的。