通過電泳區(qū)分不同的蛋白組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持物（膜），通過特異性試劑（抗體）作為探針，對靶物質(zhì)進行檢測?？蓹z測到低至1～5ng（Low可到10～100pg）中等大小的靶蛋白。

實驗結(jié)果展示：

WB（普通蛋白,磷酸化蛋白)實驗流程：

　　 Western Blot實驗步驟

        1、 細胞總蛋白提取

      （1）對于懸浮細胞: 離心收集細胞，每106細胞加250 ul  RIPA（在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑），振蕩。如果需要提高蛋白濃度，可以適當減少細胞總蛋白提取試劑體積。

      （2） 對于貼壁細胞:

        ① 用TBS沖洗細胞2-3次。最后一次*吸干殘留液。

        ② 加入適當體積的 RIPA（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）于培養(yǎng)板、瓶內(nèi)3-5min。期間反復(fù)晃動培養(yǎng)板、瓶，使試劑與細胞充分接觸。

        ③ 用細胞刮刀將細胞及試劑刮下，收集到1.5ml離心管中。

      （3） 冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細胞*裂解。

      （4） 12000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。

        2、 組織蛋白提取：

      （1） 組織塊用冷TBS洗滌2-3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器。加入10倍組織體積本試劑（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）冰上*勻漿。如果需要提高蛋白濃度，可以適量減少該試劑體積。

      （2） 將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細胞*裂解。

      （3） 12000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。

        3、 蛋白濃度測定：BCA法側(cè)蛋白濃度

        4、 SDS-PAGE電泳

      （1） 清洗玻璃板

      （2）灌膠與上樣

        ① 將玻璃板對齊后放入夾中卡緊，操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。

        ② 按實驗安排配制分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。大約45min后可倒去膠上層水并用吸水紙將剩余水吸干。

     分離膠配比

 ③ 按前面方法配5%的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。

（3） 加足夠的電泳液后上樣電泳。將樣品加入電泳孔中，電泳。濃縮膠電壓75V，分離膠用120V。電泳至溴酚藍剛跑出即可終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。

5 轉(zhuǎn)膜  （小于20kd的蛋白請使用0.22um的PVDF膜。）

（1）準備6張7×9cm的濾紙和一張大小適中的 PVDF膜，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。

（2） 在加有轉(zhuǎn)移液的盆里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子，兩塊海綿墊，一支玻棒，濾紙和經(jīng)過活化的PVDF膜。

（3）將夾子打開使黑的一面保持水平。在墊子上墊海綿、三層濾紙。

（4）小心剝下分離膠蓋于濾紙上，將膜蓋于膠上，并除氣泡。在膜上蓋三張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊。

（5）轉(zhuǎn)膜條件（濕轉(zhuǎn)）

 ① 快轉(zhuǎn)。300mA恒流轉(zhuǎn)膜半小時，或者200mA轉(zhuǎn)膜1小時，時間可以略微調(diào)整，時間對應(yīng)調(diào)整。

 ② 慢轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜過夜，25V恒壓轉(zhuǎn)膜過夜。

  6 免疫反應(yīng)

 ① 將轉(zhuǎn)好的膜于室溫下脫色搖床上用5%的脫脂牛奶(0.5%TBST配)，封閉1h。

 ① 稀釋一抗（TBST溶解的5%脫脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA），4℃孵育過夜（快轉(zhuǎn)），或者4℃孵育抗體3小時（慢轉(zhuǎn)）。

 ③用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min

 ④ 將二抗用TBST稀釋3000倍，室溫下孵育30min后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min

  7 化學(xué)發(fā)光 將ECLA和ECLB兩種試劑在離心管中等體積混合，將PVDF膜的蛋白面朝上與此混合液充分接觸，1-2min后，去盡殘液，包好，放入暗匣中曝光。最后用顯影、定影試劑進行顯影和定影。根據(jù)不同的光強度調(diào)整曝光條件。

  8 凝膠圖像分析 將膠片進行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

蛋白樣品制備的注意事項：

     1、細胞數(shù)量達5×106

     2、將細胞裂解液再離心，收集上清液，加loading煮樣5min。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳注意事項：

    1、做膠：防止漏膠、進氣泡以及花膠（水封、插梳子和拔梳子）

    2、加樣：兩邊加loading，加樣量一樣，加樣時間要盡量短，以免樣品擴散。

    3、電泳：將膠夾好放于電泳槽中，加電泳buffer（內(nèi)外面不能聯(lián)通），將電壓調(diào)到90V開始電泳。

轉(zhuǎn)膜注意事項：

     1、泡膜：轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移buffer浸泡20min。（1.凝膠若是沒在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡，就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形。2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡）

    2、轉(zhuǎn)膜順序：陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板

    3、轉(zhuǎn)膜條件：0.35A 250V 1h40min 冰浴中進行轉(zhuǎn)膜（具體轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，反之則短）

    4、避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉(zhuǎn)膜效率并會使膜臟掉。

    5、夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不*。

    6、保證膜和濾紙的大小和凝膠*一樣，過大和過小都會影響轉(zhuǎn)膜效率。

    7、雞來源的抗體與PVDF和尼龍膜有較強的結(jié)合能力，從而產(chǎn)生較高的背景，故如果選擇雞來源的抗體最好使用硝酸纖維素膜（NC膜）

關(guān)于磷酸化蛋白檢測的注意事項：

   1、保持待測蛋白處于磷酸化狀態(tài)！在標本提取液中加入足夠的磷酸酶抑制劑（NaF，可以防止去磷酸化），并將標本時刻保持在冰浴中！

   2、使用5%的BSA作為封閉試劑！不能使用脫脂奶粉?。ㄒ驗槊撝谭壑泻欣业鞍?，會出現(xiàn)很高的背景）。

抗體保存注意事項：

  1、收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進行分裝盒保存！

  2、對于大部分抗體，比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃

（1）分裝的量以一次實驗用完為好，最少不能少于10μl每份。因為分裝體積越小，抗體的濃度越可能會受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。

（2）復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在4℃，避免再凍起來！

（3） 絕對避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。

  3、大部分抗體收到后4℃短暫保存1-2周對抗體活性是沒有影響的。

  4、長期保存，加入疊氮鈉，防止細菌污染。