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WB(普通蛋白,磷酸化蛋白)

簡要描述:WB(普通蛋白,磷酸化蛋白),通過電泳區(qū)分不同的蛋白組分,并轉(zhuǎn)移至固相支持物(膜),通過特異性試劑(抗體)作為探針,對靶物質(zhì)進行檢測??蓹z測到低至1~5ng(可到10~100pg)中等大小的靶蛋白。

  • 產(chǎn)品型號:
  • 廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
  • 更新時間:2024-10-12
  • 訪  問  量:3201
詳情介紹

實驗收費標準:

項目編號項目名稱計價單位單價

ZC1102

WB(普通蛋白,磷酸化蛋白)

140元

WB(普通蛋白,磷酸化蛋白)服務(wù)介紹:

      通過電泳區(qū)分不同的蛋白組分,并轉(zhuǎn)移至固相支持物(膜),通過特異性試劑(抗體)作為探針,對靶物質(zhì)進行檢測??蓹z測到低至1~5ng(Low可到10~100pg)中等大小的靶蛋白。


實驗結(jié)果展示:

WB(普通蛋白,磷酸化蛋白)


WB(普通蛋白,磷酸化蛋白)實驗流程:

   Western Blot實驗步驟

        1、 細胞總蛋白提取

      (1)對于懸浮細胞: 離心收集細胞,每106細胞加250 ul  RIPA(在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑),振蕩。如果需要提高蛋白濃度,可以適當減少細胞總蛋白提取試劑體積。

      (2) 對于貼壁細胞:

        ① 用TBS沖洗細胞2-3次。最后一次*吸干殘留液。

        ② 加入適當體積的 RIPA(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)于培養(yǎng)板、瓶內(nèi)3-5min。期間反復(fù)晃動培養(yǎng)板、瓶,使試劑與細胞充分接觸。

        ③ 用細胞刮刀將細胞及試劑刮下,收集到1.5ml離心管中。

      (3) 冰浴30min,期間用移液器反復(fù)吹打,確保細胞*裂解。

      (4) 12000g離心5min,收集上清,即為總蛋白溶液。

        2、 組織蛋白提取:

      (1) 組織塊用冷TBS洗滌2-3次,去除血污,剪成小塊置于勻漿器。加入10倍組織體積本試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)冰上*勻漿。如果需要提高蛋白濃度,可以適量減少該試劑體積。

      (2) 將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中,振蕩。冰浴30min,期間用移液器反復(fù)吹打,確保細胞*裂解。

      (3) 12000g離心5min,收集上清,即為總蛋白溶液。

        3、 蛋白濃度測定:BCA法側(cè)蛋白濃度

        4、 SDS-PAGE電泳

      (1) 清洗玻璃板

      (2)灌膠與上樣

        ① 將玻璃板對齊后放入夾中卡緊,操作時要使兩玻璃對齊,以免漏膠。

        ② 按實驗安排配制分離膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。大約45min后可倒去膠上層水并用吸水紙將剩余水吸干。

     分離膠配比


分離膠濃度
試劑8%10%12%15%18%20%8%10%12%15%18%20%
H2O   ml4.6343.32.31.30.636.95.94.93.41.90.9
30%丙烯酰胺(29:1) ml2.673.34566.674567.5910
1.5M TRIS-Hcl(PH 8.8) ml2.52.52.52.52.52.53.83.83.83.83.83.8
10%SDS ml0.10.10.10.10.10.10.150.150.150.150.150.15
AP  ml0.10.10.10.10.10.10.150.150.150.150.150.15
TEMED  ul5ul5ul5ul5ul5ul5ul7.5ul7.5ul7.5ul7.5ul7.5ul7.5ul
總體積 ml10ml15ml

   

    5%濃縮膠配比
試劑濃度   5%
H2O ml2346
30%丙烯酰胺(29:1)ml0.50.7511.5
1M  TRIS-Hcl(PH 6.8)ml0.50.7511.5
10%SDS ul406080120
AP  ul30456090
TEMED  ul4ul6ul8ul12ul
總體積 ml3ml4.5ml6ml9ml

 ③ 按前面方法配5%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。

(3) 加足夠的電泳液后上樣電泳。將樣品加入電泳孔中,電泳。濃縮膠電壓75V,分離膠用120V。電泳至溴酚藍剛跑出即可終止電泳,進行轉(zhuǎn)膜。

5 轉(zhuǎn)膜  (小于20kd的蛋白請使用0.22um的PVDF膜。)

(1)準備6張7×9cm的濾紙和一張大小適中的 PVDF膜,PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。

(2) 在加有轉(zhuǎn)移液的盆里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子,兩塊海綿墊,一支玻棒,濾紙和經(jīng)過活化的PVDF膜。

(3)將夾子打開使黑的一面保持水平。在墊子上墊海綿、三層濾紙。

(4)小心剝下分離膠蓋于濾紙上,將膜蓋于膠上,并除氣泡。在膜上蓋三張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊。

(5)轉(zhuǎn)膜條件(濕轉(zhuǎn))

 ① 快轉(zhuǎn)。300mA恒流轉(zhuǎn)膜半小時,或者200mA轉(zhuǎn)膜1小時,時間可以略微調(diào)整,時間對應(yīng)調(diào)整。

 ② 慢轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜過夜,25V恒壓轉(zhuǎn)膜過夜。

  6 免疫反應(yīng)

 ① 將轉(zhuǎn)好的膜于室溫下脫色搖床上用5%的脫脂牛奶(0.5%TBST配),封閉1h。

 ① 稀釋一抗(TBST溶解的5%脫脂牛奶,磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA),4℃孵育過夜(快轉(zhuǎn)),或者4℃孵育抗體3小時(慢轉(zhuǎn))。

 ③用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次,每次5min

 ④ 將二抗用TBST稀釋3000倍,室溫下孵育30min后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次,每次5min

  7 化學(xué)發(fā)光 將ECLA和ECLB兩種試劑在離心管中等體積混合,將PVDF膜的蛋白面朝上與此混合液充分接觸,1-2min后,去盡殘液,包好,放入暗匣中曝光。最后用顯影、定影試劑進行顯影和定影。根據(jù)不同的光強度調(diào)整曝光條件。

  8 凝膠圖像分析 將膠片進行掃描存檔,PhotoShop整理去色,Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

蛋白樣品制備的注意事項:

     1、細胞數(shù)量達5×106

     2、將細胞裂解液再離心,收集上清液,加loading煮樣5min。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳注意事項:

    1、做膠:防止漏膠、進氣泡以及花膠(水封、插梳子和拔梳子)

    2、加樣:兩邊加loading,加樣量一樣,加樣時間要盡量短,以免樣品擴散。

    3、電泳:將膠夾好放于電泳槽中,加電泳buffer(內(nèi)外面不能聯(lián)通),將電壓調(diào)到90V開始電泳。

轉(zhuǎn)膜注意事項:

     1、泡膜:轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移buffer浸泡20min。(1.凝膠若是沒在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡,就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮,導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形。2.PVDF膜具有疏水性,需用甲醇浸泡)

    2、轉(zhuǎn)膜順序:陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板

    3、轉(zhuǎn)膜條件:0.35A 250V 1h40min 冰浴中進行轉(zhuǎn)膜(具體轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定;目的蛋白的分子量越大,需要的轉(zhuǎn)膜時間越長,反之則短)

    4、避免直接用手碰雜交膜,使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉(zhuǎn)膜效率并會使膜臟掉。

    5、夾好膜和凝膠后,確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在,否則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不*。

    6、保證膜和濾紙的大小和凝膠*一樣,過大和過小都會影響轉(zhuǎn)膜效率。

    7、雞來源的抗體與PVDF和尼龍膜有較強的結(jié)合能力,從而產(chǎn)生較高的背景,故如果選擇雞來源的抗體最好使用硝酸纖維素膜(NC膜)

關(guān)于磷酸化蛋白檢測的注意事項:

   1、保持待測蛋白處于磷酸化狀態(tài)!在標本提取液中加入足夠的磷酸酶抑制劑(NaF,可以防止去磷酸化),并將標本時刻保持在冰浴中!

   2、使用5%的BSA作為封閉試劑!不能使用脫脂奶粉?。ㄒ驗槊撝谭壑泻欣业鞍?,會出現(xiàn)很高的背景)。

抗體保存注意事項:

  1、收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進行分裝盒保存!

  2、對于大部分抗體,比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃

(1)分裝的量以一次實驗用完為好,最少不能少于10μl每份。因為分裝體積越小,抗體的濃度越可能會受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。

(2)復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完,將剩余母液保存在4℃,避免再凍起來!

(3) 絕對避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。

  3、大部分抗體收到后4℃短暫保存1-2周對抗體活性是沒有影響的。

  4、長期保存,加入疊氮鈉,防止細菌污染。

 

 






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